Pribolab - EKT-GM060-96TPriboFast®CP4 EPSPS转基因酶联免疫检测试剂盒 PriboFast®CP4 EPSPS ELISA Kit-28071

【概要】

CP4 EPSPS 是一种抗草甘膦蛋白，常用于作物育种。转入该基因的农作物，可以让氮代谢显著增加，从而抵消草甘膦除草剂对农作物的作用，进而选择性地杀死杂草。本试剂盒采用双抗夹心 ELISA 方法，可定性、定量检测作物样本中CP4 EPSPS 含量，与仪器分析技术相比具有快速、简便、灵敏和高通量等特点，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

PriboFast® CP4 EPSPS 转基因酶联免疫检测试剂盒是一个高敏度的CP4 EPSPS 检测系统， 能定量检测叶片、种子和散粮等样本中的CP4 EPSPS成分。

【检测原理】

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA检测样本中的CP4 EPSPS 转基因成分。在酶标板微孔条上预包被特异性针对CP4 EPSPS的单克隆抗体。当加入含CP4 EPSPS的样本后，微孔条上预包被的CP4EPSPS抗体将其捕获，形成抗体-抗原复合物（Ag-Ab），随后加入酶标抗体（Ab-HRP）与抗原抗体复合物结合，最终形成抗体-抗原-酶标抗体复合物（Ab-Ag-Ab-HRP），而后通过酶催化TMB底物试剂显色，终止后进行酶标仪读值。样本吸光度值与其所含CP4 EPSRS含量成正相关，与标准曲线比较，即可计算出样品中CP4 ERSPS的含量。

【需要而未提供的设备及试剂】

酶标仪（450nm），温箱，振荡器，涡旋仪，离心机，聚苯乙烯离心管：1.5mL，微量移液器：单道20 μL~200 μL、100 μL~1000 μL、多道250 μL，新鲜的超纯水或去离子水。

【试剂配制】

1. 洗涤工作液：用去离子水将20X浓缩洗涤液按 1：19 体积比进行稀释（1份20X浓缩洗涤液+19 份去离子水），用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在 4 ℃环境可保存1个月。

2. 标准品配置：用1mL样品提取液溶解CP4 EPSPS标准品，此溶液浓度为 48 ppb；

取CP4 EPSPS标准品 48 ppb，300 μL加入样品提取液 300 μL，此溶液浓度为24 ppb；

取CP4 EPSPS标准品 24 ppb，300 μL加入样品提取液 300 μL，此溶液浓度为12 ppb；

取CP4 EPSPS标准品 12 ppb，300 μL加入样品提取液 300μL，此溶液浓度为6 ppb；

取CP4 EPSPS标准品 6 ppb，300 μL加入样品提取液 300 μL，此溶液浓度为 3 ppb；

标准品溶液稀释后请避光，-20℃保存，保存时间为14天。

3. 酶标工作液：用酶稀释液将 11X浓缩酶标液按1:10体积比进行稀释（1份11X浓缩酶标液+10份酶稀释液），例如180μL 11X浓缩酶标液+1.8mL酶稀释液，可用于16 孔的测定。

【样本前处理步骤】

样本处理前须知

   处理任何样本时，都必须注意:

   1. 实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头；

1. 实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果；
2. 叶片样本如采集后不能立即检测，应-20℃保存，时间不超过1个星期；
3. 采集的种子样品应保存阴凉干燥环境下，时间不超过6个月；
4. 样本稀释因子为 10。

（一）叶片前处理方法

1. 取 0.05 g的叶片（约 1cm²），放入 1.5 mL 离心管中捣碎（注：请用不同的器物进行捣碎，防止交叉污染）；

2. 加入0.5 mL的样品提取液，振荡混匀5分钟；

3. 4000 rpm 离心3分钟；

4. 取 100 μL上清用于分析。

（二）种子前处理方法

   1. 取0.1 g碾碎后的种子样本；

2. 放入1.5 mL离心管中，加入1 mL样品提取液，振荡混匀5分钟；

3. 4000 rpm离心3分钟；

4. 取100 μL上清用于分析。

（三）散粮前处理方法

1. 取15 g碾碎后的散粮样本；

2. 放入适当容器中，加入75 mL纯水，振荡混匀5分钟；

3. 4000 rpm离心3分钟；

4.取250μL离心后的上清，加入250 μL的样品提取液混匀；

5. 取100 μL混匀后的溶液用于分析。

【操作步骤】

任何情况下，标准品需设置两组重复。当待测样品数量较多时，标准品必须在样品加入前和加入后各加一次。在最后计算时，须使用重复孔的算数平均值。参考 GLP 准则和质量控制的要求 ，待测样品的重复是同样必要的。

1. 按照上述制备步骤制备样本。

2. 每孔加入 100 μL 标准品或样品待测液，每个样品设置两组重复。 25℃下孵育 45 min。

3. 按如下步骤洗板 4 次：每个孔里加入 300 μL 洗涤液，翻转板子倒掉，用板子快速拍击纸巾。重复以上步骤直至拍干。洗涤过程至关重要，洗涤不足会导致精确度较差和吸光度假性升高。

4. 每孔加入 100 μL 酶标工作液，轻轻振荡混匀，25℃下孵育 30 min。

5. 按照步骤 3 再洗板 4 次。

6. 每孔加入 100 μL 显色液，25℃下避光反应 15 min。

8. 每个孔里加入 100 μL 终止液，孔液由蓝色变为黄色。

9. 用酶标仪 450 nm 测吸光度（参考波长 630nm），5 min内完成数据读取。  

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法，计算值乘以样本稀释因子即为样本中的含量。注意样本吸光值与其所含 CP4 EPSPS 量成正相关。

1. 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其检测值范围（ppb）。例如样本1的吸光度值为0.658，样本2的吸光度值为1.358；标准品吸光度值分别是：6ppb为0.3272，12ppb为0.5723，24ppb为0.8647，48ppb为1.6162则样本1的检测值范围是12-24ppb,样本2的检测值范围是24-48 ppb 。

2. 定量分析

(1) 标准品吸光度值的计算，标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)减去样品稀释液（本底）的吸光度值。

(2) 标准曲线的绘制与计算

以标准品吸光度值为x轴，以CP4 EPSPS标准品浓度（ppb）为y轴，绘制标准曲线图。将样本的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

【注意事项】

1. 实验开始前，将所有试剂恢复至室温(20-25°C)。
2. 所有试剂使用前，应轻轻翻转或旋转混合，避免诱发泡沫。
3. 一旦试验开始，应在建议的时间限制内不中断地完成所有的后续步骤。
4. 所有试剂用完后，扣好瓶盖，避免混用瓶盖。
5. 每个样品使用单独的一次性的吸头，防止交叉污染。
6. 所有的样品和标准应在同时间测定，以使所有的测试条件相同。
7. 禁止混用不同批次试剂或使用过期试剂。
8. 在实验过程中，检查实验设备的精度和准确度（如微量管, 酶标仪等）。
9. 本试剂盒标准品仅适用于标准曲线配置，不用于其他用途。

【安全指南】

1. 禁止在实验室内吸烟、饮食或用嘴吸移液管。

2. 实验前请佩戴一次性手套。

3. 皮肤和粘膜禁止接触显色液和终止液（可能发生刺激、烧伤或毒性危害）。一旦接触须立即用大量清水冲洗受伤区域。

4. 请根据 GLP 规范保管和处理化学物品。

【贮藏条件及保存期】

贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃

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